DaisyD’s BioBlog

Evaluación de afiches

Afiches evaluados

Afiche A-12

Nombre del estudiante: Melody M. López Méndez

Titulo del Proyecto: Cloning and Expression of hCen2 and Interacting Proteins

Afiche A-7

Nombre del estudiante: Rocío del C. Arroyave

Titulo del Proyecto: Vibrational Study of the Interactions Between Glutathione and cis-[PtCl(NH₃)₂(thiazole)]+

Afiche A-17

Nombre del estudiante: Iriselies Meléndez Rodríguez

Titulo del Proyecto: Synthesis of Pltinum(II) Complexes of the Type cis-[PtCl₂(Am₂)]

Durante la presentacion del afiches del Bio Minds Research Day celebrado el 21 de marzo de 2009 en el Bioprocess Development and Training Complex tuve la oportunidad de aprender acerca del proyecto de investigacion de Melody M. López Méndez, Rocío del C. Arroyave e Iriselis Meléndez Rodríguez. En general, todos los afiches contaban los componentes requeridos proveyendo la información requerida para cada componente del afiche. La información estaba presentada de forma clara y todas explicaron muy bien su proyecto y demostraron su dominio acerca del tema al responder todas mis preguntas. Me pareció excelente la presentación de las tres compañeras y me hubiese gustado tener más tiempo disponible para conocer aun mas acerca del proyecto de cada una el día de la actividad. 

Project Title: Translational Control of Human Interleukin-3 Mediated by its 3’-Untranslated Region

Authors: Daisy D. Colón-López, Marimar Hernández-Pérez, José A. González-Feliciano  and Carlos I. González Ph.D.

University: University of Puerto Rico – Río Piedras

Department: Department of Biology

Category: Molecular Biology

Abstract:

Human interleukin-3 (IL-3) is a cytokine that stimulates the growth and differentiation of early lymphoid stem cells and has been implicated in cancer. IL-3 is a member of a class of transiently expressed mRNAs that harbor Adenosine/Uridine-Rich Elements (ARE) in their 3’-UTRs. The 3’-UTRs of many cytokines play a role in post-transcriptional control by altering mRNA stability and/or translation. The regulatory effects of 3’UTR’s are often mediated by the interaction of specific cis-acting elements with trans-acting factors. To understand how the ARE sequences from the 3′-UTR of the hIL-3 are involved in controlling translation, we conducted a site-directed mutagenesis analysis of the four AREs clusters recently identified in the hIL-3 3’UTR. Firefly luciferase reporter chimeras harboring specific ARE mutations were constructed and transfected into HeLa cells. Dual luciferase assays and quantitative Real Time-PCR were used to measure protein and mRNA levels, respectively. The results from this analysis demonstrate that mutations in the hIL-3 nonamer sequences, ARE2 and ARE3, affect the translational efficiency of the luciferase reporter chimeras. Our data further suggest an important role for these AREs in the translational control of hIL-3. Ongoing studies in the laboratory are focused on the identification and characterization of the trans-acting factors that interact with the ARE2 and ARE3 sequences in hIL-3 3’-UTR. Together, these studies can potentially provide powerful tools for regulating IL-3 gene expression and preventing certain types of cancer.

This work was supported by grants from the National Institutes of Health to C.I.G. (GM008102-3052, KO1 HL-04355-05, U54 CA96297-03, P20 RR 016174). M.H. is supported by the RISE Program (UPR-MSC). D.D.C.L. was supported by PRLS-AMP and is currently supported by the RISE Program (2 R25 GM061151) and BioMinds.

El progreso que he logrado en este semestre, hasta ahora, considero que es de un 2 usando una escala de 1-5. Por lo menos he logrado aproximadamente un 10 % de los objetivos propuestos para este semestre. Ha habido un poco de dificultades en los experimentos de qRT-PCR y del polysome profile. Para el qRT-PCR nos hemos estado entrenando para conocer mejor como trabajar con la máquina. Tuvimos que esperar a que llegara todo el equipo y tomáramos un entrenamiento en el taller pero ya estamos listos para seguir trabajando en estos experimentos. Con el polysome profile también se ha tenido algunas dificultades. La primera vez que se intento el experimento hubo una falla con la centrifuga y hubo que revisar el equipo para luego volver a intentarlo. Aun nos falta volver a repetir el experimento para corroborar los resultados. Yo nunca había realizado este experimento anteriormente por lo que hay que prepararse lo mejor posible y estar dispuesto a enfrentar los imprevistos y los problemas que se presentan a la hora de hacer el experimento. Mientras más se practica y se domina una técnica más fácil es luego evitar, o resolver problemas en el momento de hacer el experimento. Por eso trabajo de la mano de una estudiante graduada y otros compañeros de laboratorio que me ayudan a aclarar dudas y resolver los problemas que se presentan. Hasta el momento todo va en marcha y espero ya pronto tener los resultados de los experimentos en los que estoy trabajando ahora mismo.

El proyecto de investigación en el que trabajo requiere de mucho más trabajo del que parece. Para hacer estos experimentos primero se tienen que cultivar las células con las que se van a trabajar. Estas células se descongelan, se dejan crecer en el medio que tiene todos lo que necesitan para crecer a la temperatura óptima para ellas. En el caso de las HeLa cells, que es una línea de células de una paciencia que tenía cáncer cervical, utilizan un medio llamado DEMEM y se incuban a 37 ºC. Estas células hay que mantenerlas viables y hay que darles un tiempo (varios días o semanas) para que estén listas para hacer las transfecciones con los plasmidios y luego proceder a hacer los experimentos. Esta es una de las razones por las cuales a veces toma tanto tiempo obtener resultados. Muchas veces fallan los equipos que se utilizan, como centrifugas por ejemplo, y el experimento no sale bien y luego hay que comenzar desde el principio. Muchas veces estas situaciones pueden ser evitadas pero otras es muy difícil. Aun hay que seguir trabajando mucho para lograr los objetivos que quiero alcanzar antes de que termine el semestre.

During the current semester, my research project will focus on identifying the role of AU-rich elements (AREs) in the translational control of hIL-3. We have recently identified four different AREs in the hIL-3 3’UTR.  As suggested by experimental results described in last semester’s progress report, these elements have a regulatory role in the human IL-3 expression. As a continuation of this project, the translational efficiency of the reporter gene Luciferase harboring the hIL-3 3′UTR will be measured using Dual Luciferase assays and quantitative RT-PCR analysis. Also, mRNA stability studies will be performed for this reporter gene using quantitative RT-PCR. The studies for Luciferase translational efficiency will also be performed on Jurkat cells during their resting state, a T-cell-derived line. Finally, polysome distribution of luciferase constructs will be analyzed. Together, these studies will aid in unraveling the mechanism(s) that control IL-3 expression in humans.

     Durante este semestre continuare con el trabajo que había comenzado el pasado semestre. Ya se lograron terminar las mutaciones de los diferentes AREs que se encuentran en la región no traducida del extremo 3’ (3’UTR) del gen de IL-3 en humanos. Solo faltaba mutar un nucleótido de los cinco que queríamos mutar del tercer ARE (ARE3). Ya obtenidas todas las mutaciones solo falta terminar los ensayos con el reportero luciferasa (Dual Luciferase Assay) y los ensayos para medir los niveles de  mRNA de los constructos a través del Real Time-PCR. Luego de completar estos experimentos se podrá calcular la eficiencia traduccional de los constructos, cada uno con un diferente ARE del 3’UTR de hIL-3 mutado cada uno. Estos experimentos permitirán elucidar los efectos de cada ARE del 3’UTR de hIL-3 en la expresión de la proteína luciferasa y de esta manera entender el rol de estos AREs en el control traduccional de hIL-3.

     La segunda meta para este semestre es repetir estos experimentos experimentos en Jurkat cells ya que estas células tienen relevancia fisiológica. Las Jurkat cells son células T. Estas células expresan hIl-3. Por esta razón también se comenzara a activar las Jurkat para ver los niveles de hIL-3 con las células activadas. Para esto, primero hay que determinar experimentalmente que agentes son mejores para activar estas células y ver en “time points” como se da la activación en estas células con los agentes que serán utilizados.

      Los resultados de los experimentos en Jurkat cells se comparan con los resultados de los experimentos que hemos estado haciendo en HeLa cells que nos han servido como modelo para estudiar los efectos de secuencias reguladoras (AREs) en la expresión de la proteína luciferasa. 

Durante este semestre pude obtener los cuatro constructos que necesitaba para estudiar los cuatro AREs contenidos en el 3’UTR de hIL-3. Uno de los constructos no se pudo mutar por completo pero aun así se pudo utilizar para los ensayos ya que aunque no se pudo mutar completo la mutación que se logro fue suficiente para romper la secuencia de ARE3 que era lo que se quería. Estos constructos permitieron estudiar el rol de cada ARE del 3’UTR en el control traduccional de hIL-3. Para esto se calculo la eficiencia traduccional de cada constructo utilizando una fórmula establecida. Esta fórmula permite calcula la eficiencia traduccional utilizando medidas del nivel de proteínas y cuantificación de mRNA. Los niveles de proteínas se obtuvieron por medio de un Dual Luciferase Assay (DLA). Los niveles de mRNA fueron determinados por medio de Real Time-PCR cuantitativo (qRT-PCR). En el DLA se observo que dos de los constructos de AREs, ARE2mut y ARE3mut recuperan la expresión de luciferasa casi igual que el 3’UTR. Por otra parte, los constructos ARE1mut y ARE4mut reprimieron la expresión de luciferasa un poco más que los constructos 3’UTR, ARE2 y ARE3. Estos resultados sugieren que el efecto que se ve en el 3’UTR puede ser consecuencia de los ARE2 y ARE3. Para el qRT-PCT los nieves de mRNA mas altos fueron observados en 3’UTR y ARE3, mientras que los más bajos fueron observados para ARE2 y ARE4. Para ARE1 los niveles fueron un poco mayores que los de ARE2 y ARE4. Luego de calcular la eficiencia traduccional se determino que para ARE1 y ARE4 la eficiencia traductional es casi la misma pero las de ARE2 y ARE3 fueron muy diferentes. La eficiencia traduccional de ARE2 es la menor de todas mientras que la de ARE3 es la más alta. Estos resultados sugieren que el efecto que se ve en 3’UTR es resultado del efecto que tienen el ARE2 y ARE3 en control traduccional. Los experimentos de este semestre fueron realizados en células HeLa. Para el próximo semestre se repetirán en células Jurkat que es una línea de células T. Estas células tienen más relevancia fisiológica que las células HeLa, que son utilizadas como modelo, ya que las Jurkat producen hIL-3. De este modo se podrá estudiar mas afondo el efecto que tienen los AREs del 3’UTR en el control traduccional de hIL-3

En estos momentos se ha logrado cerca de un 50 % del proyecto. Ya la parte del proyecto más difícil, que es hacer los constructos utilizando la técnica de “site-directed mutagenesis”, está casi completada. Solo falta mutar dos nucleótidos de uno de los AREs para terminar el constructo que hacía falta que no se había logrado mutar  de una sola vez los 6 nucleótidos que estamos mutando. Por el momento, estamos repitiendo las transfecciones en los ensayos con luciferasa para comparar los resultados de los experimentos y ver si son consistentes. Ahora mismo no podemos llegar a una conclusión hasta que terminemos las repeticiones y podamos estudiar mejor el patrón de expresión de los diferentes constructos. Aun así, los resultados obtenidos hasta el momento sugieren que dos de los elementos ARE del 3’UTR de hIL-3 afectan la expresión de luciferasa en los ensayos en células HeLa. Los experimentos están marchando bien y no ha habido mayores inconvenientes hasta el momento. Ya para la próxima entrada espero haber logrado cerca de un 75 % de las metas de este semestre para añadir más resultados. 

Técnicas y su uso en mi proyecto

 Durante los meses de agosto y septiembre he estado trabajando con técnicas de tranfeccion de células HeLa con los plasmidios que contienen las distintas mutaciones que se han hecho a los ARE contenidos en el 3’UTR de hIL-3. Luego de 48 horas de transfectar las células realice un Dual Luciferase Assay para medir la actividad de el gen reportero, luciferasa, con su control interno, renilla. Este ensayo permite determinar la cantidad de luminicencia emitida por luciferasa que es expresada por los plasmidios que contienen la secuencia que codifica para esta proteína, además del 3’UTR de hIL-3 con las secuencias que se están estudiando. Esta técnica nos permite estudiar el efecto que tienen estas secuencias en la expresión de luciferasa.

Por el momento he estado trabajando, en su mayoría, con técnicas que ya me eran familiares anteriormente. Esta semana comencé los preparativos para aprender la técnica de qRT-PCR. Aun no he podido aprender bien la técnica porque nos llego el equipo el día de ayer al laboratorio y hoy se estaba calibrando para poder utilizarlo.

Progreso logrado hasta el momento y dificultades encontradas

En una escala del 1-5 el progreso que he logrado en relación a las metas establecidas yo considero que mi proyecto, hasta el momento, tiene un 2 en progreso ya que se ha logrado aproximadamente en un 25 %. Aun no he logrado llegar a un 50% del proyecto ya que hemos tenido dificultades para mutar algunos de los AREs del 3’UTR de hIL-3. Se diseñaron nuevos primers para hacer las mutaciones por medio de PCR modificando el tamaño y limitando la cantidad de nucleótidos que se mutan en una sola reacción para tener mayor probabilidad de obtener el producto deseado. Aun no están todas las mutaciones que deseamos tener pero hemos comenzado a trabajar con las que hemos obtenido hasta el momento. Para el próximo mes espero haber logrado más de un 65 % de mis metas para este semestre.

Actividades investigativas en el verano 2008

Durante el verano del 2008 estuve participando del internado de verano Diversity Summer Internship Program en el Bloomberg School of Public Health de la universidad de Johns Hopkins en Baltimore, Maryland. La duración de este verano fue de 10 semanas en las cuales tuve la oportunidad de participar de seminarios, tres presentaciones de posters, además de hacer investigación en el laboratorio del Dr. Roger McMacken en el departamento de Bioquímica y Biología Molecular.

Mi proyecto de investigación tenía como objetivo caracterizar una mutante de una proteína que está envuelta en la iniciación de replicación de DNA del bacteriófago lambda (λ) mediante la expresión, purificación y haciendo análisis funcionales de esta proteína llamada proteína O del bacteriófago λ (λ O). Esta proteína es necesaria para que pueda iniciarse la replicación de DNA de λ. O se enlaza como dímero a cada uno de los cuatro lugares donde O se enlaza en el origen de replicación de λ doblando el DNA aproximadamente 80 º. Esto permite la formación de una estructura parecida a un nucleosoma que se le conoce como O-soma. Esto permite la preparación del DNA para traer la maquinaria que comenzara la replicación de DNA.

Para entender a nivel bioquímico y moléculas las interacciones entre DNA y las proteínas que se enlazan al mismo se hicieron mutaciones sencillas a residuos de aminoácidos en el dominio del terminal N de λ O para identificar residuos importantes para que esta proteína pueda enlazarse al origen de replicación de λ. En estudios previos se encontró que algunos aminoácidos afectaban la capacidad de la proteína a enlazarse al DNA porque afectaban la dimerización de la misma y si O no es un dímero no puede enlazarse al DNA. Por otro lado, había otros residuos que demostraron estar envueltos directamente en el enlace de O con el DNA. En estos estudios no se incluyo una de las mutantes que demostró ser deficiente en enlazarse al DNA. Esta mutación fue una sustitución de una lisina por una alanina en la posición 90 (K90A). Mi trabajo era determinar si esta mutación afectaba la dimerización de la proteína o si verdaderamente esta mutación afectaba  la capacidad de esta proteína para enlazarse al origen de replicación de λ.

Luego de expresar y purificar la proteína O K90A pude probar que esta mutación no afectaba la dimerización de la proteína, como tampoco así su estructura tridimensional. El ensayo de replicación in vitro realizado sugiere que O K90A es funcional pero no tan eficiente como O wild type ya que se necesitó el doble de concentración de la mutante para iniciar replicación de DNA. Por otro lado, un Electrophoretic Mobility Shift Assay sugiere que  O K90A tiene poca afinidad por el DNA ya que no se observo que esta mutante se enlazara al DNA mientras que la O wild type si lo hizo, aun cuando se le añadieron mayores cantidades de la mutante. En conclusión, el residuo de aminoácido lisina en la posición 90 es importante para que la proteína O pueda enlazarse al DNA.

Propuesta de investigación para el semestre, relación de este semestre con el trabajo del semestre anterior y nuevas técnicas a desarrollar.

Al finalizar este semestre espero haber logrado mutar los cinco elementos ricos en adenina y uracilo (AREs) del 3’UTR de Il-3 en humanos (hIl-3) para determinar el rol de estas secuencias en la regulacion post-transcripcional de hIl-3. Ahora mismo se están llevando a mutaciones utilizando mediante la técnica de “site directed mutagenesis” que se lleva a cabo utilizando “primers”  diseñados para reacción en cadena de polimerasa (PCR) que permiten cambiar nucleótidos en específicos encontrados en un secuencia dada en el DNA. Estas mutaciones se confirman por secuenciación para luego amplificar el DNA en Escherichia coli, purificarlo y poder transfectar células humanas para estudiar el efecto que tienen estas mutaciones en el constructo con el reportero de luciferasa. De esta manera se medirá la eficiencia traduccional de estas mutantes utilizando un “Dual Luciferase Assay”. También se cuantificaran los niveles de mRNA para determinar la media vida del mensajero. Además, espero poder hacer un análisis cinético de la deadelilación de estas mutante por medio de un “Poly(A) test”.

Estos experimentos me permitirán estudiar los AREs dándole otro enfoque a mi proyecto permitiéndome así estudiar cada ARE contenido en el 3’UTR de hIL-3. De esta manera podré determinar la importancia de cada uno de estos elementos en la regulación post-transcripcional de este gen. A diferencia del semestre anterior, se estará eliminando el ARE mutando solamente varios nucleótidos y no eliminando la secuencia por completo del 3’UTR. Esto me permitirá entender mejor el rol de estas secuencias manteniendo constante el tamaño del constructo, la cantidad de nucleótidos y la relación de distancia entre todas las secuencias contenidas en el 3’UTR de hIL-3.

Durante este semestre aprendi a ver desde otro punto de vista el trabajo de investigacion en el que he estado participando hace dos años. He logrado entender mucho mejor algunos aspectos de la biologia molecular que antes se me hacian mas dificil comprender. La clase de quimica organica me a ayudado mucho en estre proceso. Trabajar en el area de biologia molcular no es facil porque no se puede ver directamente lo que esta ocurriendo en los experimentos. No es muy dificil cometer errores cuando se trabaja con algo que uno no ve y muchas veces hay que realizar varios experimentos para saber si todo ha salido bien. Yo trabajo diseñando constructos con plasmidios que tienen un reportero de luciferasa y secuencias dentro del 3′UTR del gen de Interlukina-3 en humanos que nos interesa estudiar que efecto tienen en el reportero de luciferasa. Para clonar estas secuencias en el plasmidio hay que diseñar primers que se utilizan para hacer PCR (polymerase chain reaction). Algunas veces se pueden cometer errores al disear los primers. Estos errores pueden corregirse al revisar las secuencias de los primers mas de una vez y por diferentes personas que ayuden a ver errores que a veces la persona que los hace no ve antes de ordenar los primers. En estos momentos ese es uno de las dificultades mas importantes que han habido en la investigacion. Esto requiere que se repitan los experimentos una vez mas para hacer un nuevo analisis de datos que nos ayuden a entender mejor el rol de estas secuencias en la regulacion post-transcripcional del gen de IL-3 en humanos.  Estamos esperando por los datos de los nuevos experimentos que estamos realizando para tomar una decision final de lo que estaremos haciendo proximamente. Durante el verano estare en internado fuera de Puerto Rico pero al regresar espero que podamos elusidar el rol de las secuencias reguladoras que hemos encontrado dentro del 3′UTR de IL-3 para luego comenzar a entender como estas secuencias funcionan. El entender el efecto que tienen estos elementos reguladores nos da una mejor idea de como es que estan trabajando y que relacion tienen entre si.