DaisyD’s BioBlog

Project Title: Translational Control of Human Interleukin-3 Mediated by its 3’-Untranslated Region

Authors: Daisy D. Colón-López, Marimar Hernández-Pérez, José A. González-Feliciano  and Carlos I. González Ph.D.

University: University of Puerto Rico – Río Piedras

Department: Department of Biology

Category: Molecular Biology

Abstract:

Human interleukin-3 (IL-3) is a cytokine that stimulates the growth and differentiation of early lymphoid stem cells and has been implicated in cancer. IL-3 is a member of a class of transiently expressed mRNAs that harbor Adenosine/Uridine-Rich Elements (ARE) in their 3’-UTRs. The 3’-UTRs of many cytokines play a role in post-transcriptional control by altering mRNA stability and/or translation. The regulatory effects of 3’UTR’s are often mediated by the interaction of specific cis-acting elements with trans-acting factors. To understand how the ARE sequences from the 3′-UTR of the hIL-3 are involved in controlling translation, we conducted a site-directed mutagenesis analysis of the four AREs clusters recently identified in the hIL-3 3’UTR. Firefly luciferase reporter chimeras harboring specific ARE mutations were constructed and transfected into HeLa cells. Dual luciferase assays and quantitative Real Time-PCR were used to measure protein and mRNA levels, respectively. The results from this analysis demonstrate that mutations in the hIL-3 nonamer sequences, ARE2 and ARE3, affect the translational efficiency of the luciferase reporter chimeras. Our data further suggest an important role for these AREs in the translational control of hIL-3. Ongoing studies in the laboratory are focused on the identification and characterization of the trans-acting factors that interact with the ARE2 and ARE3 sequences in hIL-3 3’-UTR. Together, these studies can potentially provide powerful tools for regulating IL-3 gene expression and preventing certain types of cancer.

This work was supported by grants from the National Institutes of Health to C.I.G. (GM008102-3052, KO1 HL-04355-05, U54 CA96297-03, P20 RR 016174). M.H. is supported by the RISE Program (UPR-MSC). D.D.C.L. was supported by PRLS-AMP and is currently supported by the RISE Program (2 R25 GM061151) and BioMinds.

El progreso que he logrado en este semestre, hasta ahora, considero que es de un 2 usando una escala de 1-5. Por lo menos he logrado aproximadamente un 10 % de los objetivos propuestos para este semestre. Ha habido un poco de dificultades en los experimentos de qRT-PCR y del polysome profile. Para el qRT-PCR nos hemos estado entrenando para conocer mejor como trabajar con la máquina. Tuvimos que esperar a que llegara todo el equipo y tomáramos un entrenamiento en el taller pero ya estamos listos para seguir trabajando en estos experimentos. Con el polysome profile también se ha tenido algunas dificultades. La primera vez que se intento el experimento hubo una falla con la centrifuga y hubo que revisar el equipo para luego volver a intentarlo. Aun nos falta volver a repetir el experimento para corroborar los resultados. Yo nunca había realizado este experimento anteriormente por lo que hay que prepararse lo mejor posible y estar dispuesto a enfrentar los imprevistos y los problemas que se presentan a la hora de hacer el experimento. Mientras más se practica y se domina una técnica más fácil es luego evitar, o resolver problemas en el momento de hacer el experimento. Por eso trabajo de la mano de una estudiante graduada y otros compañeros de laboratorio que me ayudan a aclarar dudas y resolver los problemas que se presentan. Hasta el momento todo va en marcha y espero ya pronto tener los resultados de los experimentos en los que estoy trabajando ahora mismo.

El proyecto de investigación en el que trabajo requiere de mucho más trabajo del que parece. Para hacer estos experimentos primero se tienen que cultivar las células con las que se van a trabajar. Estas células se descongelan, se dejan crecer en el medio que tiene todos lo que necesitan para crecer a la temperatura óptima para ellas. En el caso de las HeLa cells, que es una línea de células de una paciencia que tenía cáncer cervical, utilizan un medio llamado DEMEM y se incuban a 37 ºC. Estas células hay que mantenerlas viables y hay que darles un tiempo (varios días o semanas) para que estén listas para hacer las transfecciones con los plasmidios y luego proceder a hacer los experimentos. Esta es una de las razones por las cuales a veces toma tanto tiempo obtener resultados. Muchas veces fallan los equipos que se utilizan, como centrifugas por ejemplo, y el experimento no sale bien y luego hay que comenzar desde el principio. Muchas veces estas situaciones pueden ser evitadas pero otras es muy difícil. Aun hay que seguir trabajando mucho para lograr los objetivos que quiero alcanzar antes de que termine el semestre.

During the current semester, my research project will focus on identifying the role of AU-rich elements (AREs) in the translational control of hIL-3. We have recently identified four different AREs in the hIL-3 3’UTR.  As suggested by experimental results described in last semester’s progress report, these elements have a regulatory role in the human IL-3 expression. As a continuation of this project, the translational efficiency of the reporter gene Luciferase harboring the hIL-3 3′UTR will be measured using Dual Luciferase assays and quantitative RT-PCR analysis. Also, mRNA stability studies will be performed for this reporter gene using quantitative RT-PCR. The studies for Luciferase translational efficiency will also be performed on Jurkat cells during their resting state, a T-cell-derived line. Finally, polysome distribution of luciferase constructs will be analyzed. Together, these studies will aid in unraveling the mechanism(s) that control IL-3 expression in humans.