DaisyD’s BioBlog

Durante este semestre pude obtener los cuatro constructos que necesitaba para estudiar los cuatro AREs contenidos en el 3’UTR de hIL-3. Uno de los constructos no se pudo mutar por completo pero aun así se pudo utilizar para los ensayos ya que aunque no se pudo mutar completo la mutación que se logro fue suficiente para romper la secuencia de ARE3 que era lo que se quería. Estos constructos permitieron estudiar el rol de cada ARE del 3’UTR en el control traduccional de hIL-3. Para esto se calculo la eficiencia traduccional de cada constructo utilizando una fórmula establecida. Esta fórmula permite calcula la eficiencia traduccional utilizando medidas del nivel de proteínas y cuantificación de mRNA. Los niveles de proteínas se obtuvieron por medio de un Dual Luciferase Assay (DLA). Los niveles de mRNA fueron determinados por medio de Real Time-PCR cuantitativo (qRT-PCR). En el DLA se observo que dos de los constructos de AREs, ARE2mut y ARE3mut recuperan la expresión de luciferasa casi igual que el 3’UTR. Por otra parte, los constructos ARE1mut y ARE4mut reprimieron la expresión de luciferasa un poco más que los constructos 3’UTR, ARE2 y ARE3. Estos resultados sugieren que el efecto que se ve en el 3’UTR puede ser consecuencia de los ARE2 y ARE3. Para el qRT-PCT los nieves de mRNA mas altos fueron observados en 3’UTR y ARE3, mientras que los más bajos fueron observados para ARE2 y ARE4. Para ARE1 los niveles fueron un poco mayores que los de ARE2 y ARE4. Luego de calcular la eficiencia traduccional se determino que para ARE1 y ARE4 la eficiencia traductional es casi la misma pero las de ARE2 y ARE3 fueron muy diferentes. La eficiencia traduccional de ARE2 es la menor de todas mientras que la de ARE3 es la más alta. Estos resultados sugieren que el efecto que se ve en 3’UTR es resultado del efecto que tienen el ARE2 y ARE3 en control traduccional. Los experimentos de este semestre fueron realizados en células HeLa. Para el próximo semestre se repetirán en células Jurkat que es una línea de células T. Estas células tienen más relevancia fisiológica que las células HeLa, que son utilizadas como modelo, ya que las Jurkat producen hIL-3. De este modo se podrá estudiar mas afondo el efecto que tienen los AREs del 3’UTR en el control traduccional de hIL-3

En estos momentos se ha logrado cerca de un 50 % del proyecto. Ya la parte del proyecto más difícil, que es hacer los constructos utilizando la técnica de “site-directed mutagenesis”, está casi completada. Solo falta mutar dos nucleótidos de uno de los AREs para terminar el constructo que hacía falta que no se había logrado mutar  de una sola vez los 6 nucleótidos que estamos mutando. Por el momento, estamos repitiendo las transfecciones en los ensayos con luciferasa para comparar los resultados de los experimentos y ver si son consistentes. Ahora mismo no podemos llegar a una conclusión hasta que terminemos las repeticiones y podamos estudiar mejor el patrón de expresión de los diferentes constructos. Aun así, los resultados obtenidos hasta el momento sugieren que dos de los elementos ARE del 3’UTR de hIL-3 afectan la expresión de luciferasa en los ensayos en células HeLa. Los experimentos están marchando bien y no ha habido mayores inconvenientes hasta el momento. Ya para la próxima entrada espero haber logrado cerca de un 75 % de las metas de este semestre para añadir más resultados.