Primera entrada – Primer Semestre 2008 – 2009
Actividades investigativas en el verano 2008
Durante el verano del 2008 estuve participando del internado de verano Diversity Summer Internship Program en el Bloomberg School of Public Health de la universidad de Johns Hopkins en Baltimore, Maryland. La duración de este verano fue de 10 semanas en las cuales tuve la oportunidad de participar de seminarios, tres presentaciones de posters, además de hacer investigación en el laboratorio del Dr. Roger McMacken en el departamento de Bioquímica y Biología Molecular.
Mi proyecto de investigación tenía como objetivo caracterizar una mutante de una proteína que está envuelta en la iniciación de replicación de DNA del bacteriófago lambda (λ) mediante la expresión, purificación y haciendo análisis funcionales de esta proteína llamada proteína O del bacteriófago λ (λ O). Esta proteína es necesaria para que pueda iniciarse la replicación de DNA de λ. O se enlaza como dímero a cada uno de los cuatro lugares donde O se enlaza en el origen de replicación de λ doblando el DNA aproximadamente 80 º. Esto permite la formación de una estructura parecida a un nucleosoma que se le conoce como O-soma. Esto permite la preparación del DNA para traer la maquinaria que comenzara la replicación de DNA.
Para entender a nivel bioquímico y moléculas las interacciones entre DNA y las proteínas que se enlazan al mismo se hicieron mutaciones sencillas a residuos de aminoácidos en el dominio del terminal N de λ O para identificar residuos importantes para que esta proteína pueda enlazarse al origen de replicación de λ. En estudios previos se encontró que algunos aminoácidos afectaban la capacidad de la proteína a enlazarse al DNA porque afectaban la dimerización de la misma y si O no es un dímero no puede enlazarse al DNA. Por otro lado, había otros residuos que demostraron estar envueltos directamente en el enlace de O con el DNA. En estos estudios no se incluyo una de las mutantes que demostró ser deficiente en enlazarse al DNA. Esta mutación fue una sustitución de una lisina por una alanina en la posición 90 (K90A). Mi trabajo era determinar si esta mutación afectaba la dimerización de la proteína o si verdaderamente esta mutación afectaba la capacidad de esta proteína para enlazarse al origen de replicación de λ.
Luego de expresar y purificar la proteína O K90A pude probar que esta mutación no afectaba la dimerización de la proteína, como tampoco así su estructura tridimensional. El ensayo de replicación in vitro realizado sugiere que O K90A es funcional pero no tan eficiente como O wild type ya que se necesitó el doble de concentración de la mutante para iniciar replicación de DNA. Por otro lado, un Electrophoretic Mobility Shift Assay sugiere que O K90A tiene poca afinidad por el DNA ya que no se observo que esta mutante se enlazara al DNA mientras que la O wild type si lo hizo, aun cuando se le añadieron mayores cantidades de la mutante. En conclusión, el residuo de aminoácido lisina en la posición 90 es importante para que la proteína O pueda enlazarse al DNA.
Propuesta de investigación para el semestre, relación de este semestre con el trabajo del semestre anterior y nuevas técnicas a desarrollar.
Al finalizar este semestre espero haber logrado mutar los cinco elementos ricos en adenina y uracilo (AREs) del 3’UTR de Il-3 en humanos (hIl-3) para determinar el rol de estas secuencias en la regulacion post-transcripcional de hIl-3. Ahora mismo se están llevando a mutaciones utilizando mediante la técnica de “site directed mutagenesis” que se lleva a cabo utilizando “primers” diseñados para reacción en cadena de polimerasa (PCR) que permiten cambiar nucleótidos en específicos encontrados en un secuencia dada en el DNA. Estas mutaciones se confirman por secuenciación para luego amplificar el DNA en Escherichia coli, purificarlo y poder transfectar células humanas para estudiar el efecto que tienen estas mutaciones en el constructo con el reportero de luciferasa. De esta manera se medirá la eficiencia traduccional de estas mutantes utilizando un “Dual Luciferase Assay”. También se cuantificaran los niveles de mRNA para determinar la media vida del mensajero. Además, espero poder hacer un análisis cinético de la deadelilación de estas mutante por medio de un “Poly(A) test”.
Estos experimentos me permitirán estudiar los AREs dándole otro enfoque a mi proyecto permitiéndome así estudiar cada ARE contenido en el 3’UTR de hIL-3. De esta manera podré determinar la importancia de cada uno de estos elementos en la regulación post-transcripcional de este gen. A diferencia del semestre anterior, se estará eliminando el ARE mutando solamente varios nucleótidos y no eliminando la secuencia por completo del 3’UTR. Esto me permitirá entender mejor el rol de estas secuencias manteniendo constante el tamaño del constructo, la cantidad de nucleótidos y la relación de distancia entre todas las secuencias contenidas en el 3’UTR de hIL-3.
